定向TOPO克隆利用5分钟的连接反应，按5´→3´方向将平末端PCR产物直接克隆到表达载体中，从而避免了亚克隆步骤，且节省了时间。
定向TOPO克隆载体的5´端为单链GTGG突出端，3´端为平末端。 The four-nucleotide overhang invades the double-strand DNA of the PCR product and anneals to the CACC sequence that you place in your 5´ primer. 随后，拓扑异构酶 I 按正确的方向连接 PCR 产物。